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绿茶多酚之所以能减轻炎症性肠病,原来靠它们!

作者:佚名 来源:MedSci梅斯 日期:2021-09-23
导读

         炎症性肠病(IBD)是胃肠道的慢性炎症性疾病,临床上主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。近年来,IBD在全球范围内变得越来越普遍。事实上,IBD与肠道菌群调节障碍相关,最近对肠道菌群及其代谢物的调控,如粪便菌群移植(FMT),在治疗IBD方面也表现出相当潜力。此外,大量流行病学证据支持日常饮食影响慢性疾病(如IBD)的风险,目前研究表明,绿茶的主要生物活性成分表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG

关键字:  炎症性肠病 

        炎症性肠病(IBD)是胃肠道的慢性炎症性疾病,临床上主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。近年来,IBD在全球范围内变得越来越普遍。事实上,IBD与肠道菌群调节障碍相关,最近对肠道菌群及其代谢物的调控,如粪便菌群移植(FMT),在治疗IBD方面也表现出相当潜力。此外,大量流行病学证据支持日常饮食影响慢性疾病(如IBD)的风险,目前研究表明,绿茶的主要生物活性成分——表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)对缓解IBD有益。然而,EGCG减轻IBD时,肠道微生物群是否及如何发挥作用尚不清楚。而这将是本研究的主要目的。

        本研究首先测试口服或直肠给药EGCG对于右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎模型的缓解作用。接下来,通过添加EGCG预处理小鼠肠道微生物群探索其在结肠炎中的抵抗作用。最后通过与粪便微生物移植(FMT)处理小鼠及无菌粪便平酯(SFF)处理小鼠对比,证明了EGCG处理供体特异性肠道微群的缓解作用。

        1、口服而非经直肠EGCG可缓解DSS诱导的结肠炎

        如图2b-e所示,与DSS组相比,口服EGCG干预显著缓解DSS诱导结肠炎,表现为疾病活动指数评分显著降低,减少体重减轻,结肠缩短缓解。然而,经直肠输注EGCG未能改善上述任何测量值。组织学分析进一步显示,口服后,结肠内炎性细胞浸润和黏膜损伤明显减弱,结肠总组织学评分明显降低(图2f和g),但经直肠EGCG未见变化。

        血浆和结肠组织中的髓过氧化物酶(MPO)和促炎细胞因子测量结果进一步说明EGCG对全身和肠道炎症反应的影响。口服EGCG后,DSS处理小鼠中IL-1β(图2h)、IL-6(图2i)、IL-8(图2j)和TNF-α(图2k)的血浆浓度显著降低。相反,经直肠EGCG未能抑制血浆中的这些细胞因子。DSS显著降低小鼠结肠中MPO的浓度,但口服EGCG可显著降低这种浓度(图2l)。此外,口服和直肠EGCG均显著降低结肠中IL-6水平(图2m), TNF-α也显示出强烈下降趋势(图2n)。然而,直肠EGCG未能降低DSS处理小鼠结肠中MPO的水平。

        综上,这些结果表明口服EGCG而非直肠EGCG,可改善临床结肠炎症状和结肠损伤。

        2、口服EGCG可抑制DSS诱导的肠道黏膜的氧化应激,改善屏障功能

        通过测定血浆和结肠总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽/ 氧化酶(GSH-px)和丙二醛(MDA),探讨EGCG对氧化应激的影响。与正常对照组相比,口服EGCG可显著抑制结肠炎小鼠血浆中T-SOD和CAT的浓度,增加MDA的水平(图3a, b和c)。然而,与正常对照组相比,DSS诱导的结肠炎小鼠血浆中T-SOD和CAT浓度的抑制并没有受到直肠EGCG的明显影响,尽管MDA水平也降低了。DSS显著降低T-AOC和 T-SOD的结肠浓度 ,但通过口服 EGCG 减弱为正常水平(图3d和e)。值得注意的是,与正常组的结肠相比,直肠 EGCG 的 GSH-px 水平显著增加。然而,口腔和直肠EGCG对减少凋亡没有明显效果。阿利新蓝染色中可见DSS显著降低了结肠上皮黏膜的厚度,口服EGCG可将这种影响减到正常(图3k)。

        这些结果表明,口服而非直肠EGCG可抑制DSS诱导的氧化应激,并减弱DSS损伤的粘膜屏障功能。

        3、口服EGCG可调节肠道菌群的组成和SCFAs的产生

        在结肠炎小鼠中,口服EGCG和直肠EGCG均未影响Alpha多样性(图4a)。PCoA显示,正常对照组和结肠炎小鼠的肠道微生物群结构分离(R2=0.337, P=0.001, Fig. 4b;R2=0.360, P=0.001,)。肠道微生物群结构分离也表现在DSS + 口服-EGCG组和DSS + 口服-PBS组(R2=0.124, P=0.028),表明结肠炎小鼠的肠道微生物群结构受到口服EGCG的显著影响。此外,直肠EGCG对粪便菌群结构有显著影响(R2=0.136,P=0.011)。在门水平上,拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门是粪便菌群中的优势门(图4c)。通过LEfSe分析,在 DSS 小鼠中,口服或直肠 EGCG 的粪便细菌分类量差异最大。

        为了进一步探讨口服或直肠EGCG对SCFAs产生的影响,我们测量了粪便中乙酸、丙酸和丁酸的浓度。DSS显著降低了所有三种SCFAs,但口服EGCG显著提高了丙酸和丁酸的产量(图4f、g和h),而直肠EGCG没有提高,在dss处理的小鼠对直肠EGCG的反应中,丁酸产量进一步显著减少。

        进一步进行Spearman相关性分析表明,阿克曼氏菌分别与血浆CAT水平(R>0.52, P <0.05), 结肠T-AOC水平(R>0.63, P <0.05)和粪便醋酸(R>0.56, P <0.05)和丁酸(R>0.65, P <0.01) 显著正相关,与血清IL-8水平呈显著负相关(R<−0.61, P <0.05)(图4i)。而结肠炎组中富集的乳酸菌与结肠TNF-α水平呈强负相关(R<−0.59, P <0.05)。

        以上结果说明,肠道微生物群的改变和结肠炎小鼠SCFA的增产是针对口服EGCG,但不是直肠EGCG,这表明肠道微生物群在缓解DSS引起的结肠炎方面可能起着关键作用。

        4、预防性补充EGCG减轻DSS引起的结肠炎

        预防性EGCG缓解了DSS治疗的小鼠结肠炎的症状,疾病活动指数显著下降(图5b) 和体重下降缓解(图5c),并结肠长度增长(图5d 和 e)。组织学分析进一步揭示,预防性EGCG抑制DSS诱发的炎症细胞渗透和对结肠粘膜的损害(图5f 和 g)。此外,预防性EGCG降低结肠炎小鼠中IL-1(图5h), IL-6 (图5i), IL-8 (图5j), 和 Tnf - α (图5k)的血浆水平。引人注目的是,通过预防性补充EGCG,DSS 提升的 MPO (图5l), IL-6 (图5m), 和 Tnf - α (图5n) 水平在很大程度上衰减到正常水平。

        这些结果共同表明,预防性补充EGCG能够抑制DSS引起的结肠炎症状、损伤和炎症。

        5、预防性补充EGCG可降低DSS诱发的氧化应激和凋亡,改善粘膜屏障功能

        预防性EGCG很大程度上降低了血浆中抗氧化酶、T-SOD和CAT的水平,而DSS显著降低了这些水平(图6a和b)。与此一致的是,DSS显著增加了血浆中的MDA,但在预防性EGCG的作用下降至正常水平(图6c)。同样,DSS可显著降低结肠中T-AOC(图6d)、T-SOD(图6e)、CAT(图6f)和GSH-px(图6g)水平,但预防性EGCG可使其基本恢复到正常水平。结肠MDA水平显著升高,但在预防EGCG的作用下降至正常水平以下(图6h)。值得注意的是,补充EGCG前甚至在健康小鼠的血浆和结肠中引发了明显的抗氧化反应(图6a-h)。TUNEL分析进一步发现,DSS显著增加了结肠黏膜中凋亡细胞的频率,而预防性EGCG则大大扭转了这一趋势(图6i和j)。此外,预防性EGCG还能减弱dss损伤的结肠黏液和结肠屏障的精细结构(图6k和l)。

        结果提示,预防性补充EGCG能够抑制dss诱导的氧化应激,调节细胞凋亡,恢复结肠黏膜屏障功能。

        6、预防性补充EGCG调节肠道菌群组成及其SCFAs的产生

        与其他三组相比,EGCG组ASV水平sob指数显著升高(p < 0.01,图7a)。PCoA分析显示,对照组和dss处理组之间有明显的分离(R2=0.479, P=0.001,图7b)。预防性EGCG对con组和EGCG组肠道菌群组成有显著影响(R2=0.173, P=0.001), DSS组和EGCG+DSS组肠道菌群组成有显著影响(R2=0.231, P=0.001)。值得注意的是,健康小鼠口服EGCG可导致包括阿克曼氏菌在内的13个细菌属的富集,而正常对照组中只有4个分类群富集(图7e)。此外,在经EGCG预处理的结肠炎小鼠中富集了8个菌属,而仅在dss组中富集了另外6个菌属(图7f)。此外,在dss处理的小鼠中,预防性EGCG完全逆转了包括乙酸(图7g)、丙酸(图7h)和丁酸(图7i)在内的SCFAs衰减。结果显示,DSS处理小鼠的14个细菌属与血浆和结肠中抗氧化或促炎介质的浓度或粪便中SCFAs的浓度显著相关(p < 0.05)。

        特别是阿克曼氏菌与血浆T-SOD (R<0.59,P<0.05)、CAT (R<0.52, P<0.05)、结肠TNF-α (R<0.52,P<0.01)、MPO (R<0.59,P<0.05)、粪便乙酸(R<0.55, P<0.05)、丙酸(R<0.55, P<0.05)、丁酸(R<0.50, P<0.05)呈正相关。与血浆MDA (R<−0.60,P<0.05)和结肠T-AOC水平(R<−0.81,P<0.01)则呈负相关(图7k)。

        综上所述,预防性EGCG可调节肠道菌群组成及其代谢,从而有可能减弱DSS诱导的肠道菌群失调。

        7、EGCG - FMT比CON - FMT和EGCG - SFF更有助于缓解结肠炎

        与其他三组相比,EGCG-FMT治疗的结肠炎小鼠体重和结肠长度增加更多,DAI和组织学损伤减少(图8b-g)。此外,与其他三组相比,EGCG-FMT治疗的结肠炎小鼠的血浆中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平下降(图8h-k),结肠中IL-6和TNF-α水平下降,MPO水平升高(图8l-n)。值得注意的是,与CON-SFF小鼠相比,EGCG-SFF也更深刻地缓解了急性结肠炎的症状,变现为体重减轻更少,DAI评分更低,结肠长度增加(图8b-g)。此外,与CON-SFF相比,EGCG-SFF可降低血浆IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平(图8h-k),以及结肠IL-6、TNF-α水平(图8h, m)。

        8、EGCG - FMT比CON - FMT和EGCG - SFF更有助于减轻结肠屏障损伤

        与其他三组相比,EGCG-FMT结肠炎小鼠血浆中T-SOD和CAT浓度升高,MDA浓度降低(图9a-c)。此外,与其他三组相比,EGCG-FMT结肠炎小鼠结肠中T-SOD和GSH-PX浓度升高, MDA浓度降低(图9e-h)。同时,与CON-FMT或EGCG- SFF相比,EGCG处理小鼠的微生物群促进了结肠炎小鼠的细胞凋亡,并保持了更好的黏液分布和结肠紧密连接的完整性(图9i-l)。值得注意的是,与CON-SFF相比,EGCG-SFF小鼠表现出相似的差异,表现为血浆中CAT水平升高,结肠中T-SOD和GSH-PX水平升高,血浆和结肠中MDA水平降低(图9a-h)。EGCG-SFF也可促进结肠上皮细胞凋亡(图9i和j)。

        9、EGCG - FMT促进了短链脂肪酸产生菌的富集和随后的短链脂肪酸的产生

        在有结肠炎的小鼠中,FMT或SFF对ASV水平sob指数没有明显影响(图10a)。PCoA分析显示四组之间(R2=0.169, P=0.003,图10b)、两组FMT之间(R2=0.094, P=0.099)、两组SFF之间(R2=0.065, P=0.406)以及CON-FMT和CON-SFF之(R2=0.148, P=0.015)的结构变化。EGCG-FMT组和EGCG-SFF组的结构明显不同(R2=0.226, P=0.001)。值得注意的是,EGCG-FMT显著富集了阿克曼氏菌(图10e)。EGCG-FMT在结肠炎小鼠体内的粪便SCFA(醋酸盐、丙酸酯和肉酸盐)的产量显著增加,而其他三组的SCFA的产量没有受到EGCG-SFF的显著影响。10f、g、 h)。

        总的来说,与CON-FMT或EGCG-SFF相比,EGCG-FMT对结肠炎小鼠结肠炎和结肠屏障损伤的缓解作用更明显。与我们的治疗和预补充试验一致,EGCG-FMT也诱导了丰富的阿克曼氏菌和增加SCFAs的产生,这表明EGCG剂量小鼠肠道微生物群对结肠炎的缓解作用。

        综上所述,口服而非经直肠补充EGCG可缓解DSS诱导的结肠炎,而它们对肠道菌群的组成和代谢产物的不同影响,暗示了肠道菌群在介导有益作用方面的中心作用。考虑到EGCG处理小鼠的微生物群的缓解作用,本研究认为EGCG对IBD进展的减缓主要是通过产生SCFAs的细菌,特别是阿克曼氏菌和随后产生的功能性SCFAs发挥作用。这些肠道微生物群的变化通常会导致保护性短链脂肪酸(如丁酸盐)的产生增加,而丁酸盐反过来会引发明显的抗氧化、抗炎和增强屏障作用,导致肠道炎症和损害的减缓(图11)。这些发现为EGCG介导的IBD缓解提供了新的见解,并将促进IBD和其他炎症性疾病的治疗和预防策略的发展。

        原文来源:

        Wu et al.Gut microbiota from green tea polyphenol-dosed mice improves intestinal epithelial homeostasis and ameliorates experimental colitis.Microbiome (2021) 9:184

        https://doi.org/10.1186/s40168-021-01115-9

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