摘要
目的 研究超微粉(UT)和微粉(FT)两种剂型通心络胶囊(DM)对糖尿病SD大鼠肾脏氧化应激[包括抗氧化酶和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶]的影响。
方法 分别给予链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠超微粉通心络胶囊(UT- DM,1 g/kg)或微粉通心络胶囊(FT -DM,1 g/kg),干预4周后,检测其肾功能、肾皮质抗氧化酶和NADPH氧化酶亚基mRNA表达的改变。
结果 糖尿病大鼠肾皮质丙二醛(MDA)含量、24 h尿蛋白(24 hUP)和肾重/体重(KW/BW)比值增加,总超氧化物歧化酶(TSOD)活性降低,谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活性升高,过氧化氢酶(CAT)活性无变化。UT-DM和FT-DM干预均可明显降低糖尿病大鼠肾皮质MDA、24 hUP和KW/BW,增高TSOD和GSH-Px活性,对CAT活性无影响。其中UT-DM对24 hUP、KW/BW、MDA、TSOD 和 GSH-Px的作用较FT-DM更明显,差异有统计学意义。糖尿病大鼠肾皮质NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA表达水平增高,采用两种剂型通心络胶囊干预后p47phox表达水平降低,两种剂型之间差异无统计学意义。在各组间NADPH氧化酶亚基p22phox mRNA表达的差异无统计学意义。
结论 通心络胶囊能增强糖尿病大鼠肾脏TSOD和GSH-Px活性,降低NADPH氧化酶p47phox的表达水平,可能因此抑制肾脏氧化应激反应,减轻糖尿病大鼠的早期肾脏损伤。
糖尿病时体内氧化应激水平明显升高,抗氧化治疗可以减缓并发症的发生和发展,因此氧化应激在糖尿病慢性微血管并发症的发生和发展中可能起重要作用。抗氧化酶包括TSOD、GSH-Px和CAT,是机体防止氧化应激损伤的重要因素。NADPH氧化酶是体内活性氧的一个重要来源,糖尿病时其表达和活性增强。
通心络胶囊是根据中医络病学说研制的中药复方制剂,具有活血通络、改善和调整血管内皮细胞功能障碍的作用。我们的研究表明,UT-DM和FT-DM两种通心络胶囊均有抑制糖尿病大鼠肾脏氧化应激的作用,从而均能减轻糖尿病大鼠早期肾脏损伤,并且UT-DM的作用优于FT-DM。
材料和方法
材料
链脲佐菌素(STZ) 购自美国Sigma公司。UT-DM和FT-DM两种通心络胶囊均由河北石家庄以岭药业股份有限公司提供。TSOD、GSH-Px、CAT和脂质过氧化物MDA测定试剂盒购自南京建成公司。血糖测定采用罗氏公司血糖测定仪。体重150~200 g的雄性SD大鼠由上海实验动物中心提供。
动物分组
研究者给予大鼠适应性饲养7天后分为:正常对照组(NC,n=8)和糖尿病组。对糖尿病组大鼠给予STZ[用前以0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 4.5)新鲜配制],以60 mg/kg体重的剂量一次性腹腔注射,1周后于其尾静脉采血测定血糖,以血糖>16.7 mmol/L确定为糖尿病模型,然后按体重随机分为:糖尿病对照组 (DMC,7只)、UT -DM(按每天1 g/kg体重灌胃,n=8)组和 FT -DM(按每天1 g/kg体重灌胃,n=8)组。研究者给予NC和DMC大鼠等量生理盐水溶液,每日灌胃给药,持续给药4周后处死。所有大鼠自由饮水,接受正常大鼠饲料和每周体重和血糖测量。
一般观察指标
在实验4周时, 研究者予以实验大鼠称体重,测血糖,用代谢笼留24 h尿液,测24 h UP排泄量。空腹麻醉下经心脏采血,迅速取出肾脏,称重,计算KW/BW比值,分离肾皮质并放入 -70℃低温冰箱保存备用。采用比色法测定肾皮质MDA、CAT、TSOD、GSH-Px水平。
NADPH氧化酶亚基p47phox和p22phox的mRNA表达 取出100 mg冰冻肾皮质,用trizol提取总RNA,电泳检测RNA的浓度和完整性。
引物 根据GenBank提供的大鼠p22phox mRNA序列(NM_024160)、p47phox(NM_053734),利用Primer Premier 5.0自行设计引物。p22phox的上游引物(5’-3’)为CGG GCT GTC CTC CAC TTA CTG C,下游引物为TGA TGG TGC CTC CAA CCT GCG。p47phox的上游引物(5’-3’)为 GGA CAC CTA TCG CCG CAA CAG,下游引物为GAT GAG GTC CGA GCT GGG TCT C。引物由上海欧易生物科技有限公司合成。
RNA样品反转录 利用 RNA 反转录试剂盒进行RNA反转录。试剂盒使用Fermentans公司的RNA PCR kit,按照试剂盒提供的反应体系进行反转录反应。
Real-time PCR 利用takara公司的SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) kit进行逆转录聚合酶链反应(real-time PCR)检测。PCR仪使用Corbet Research公司的Rotor-Gene 3000。采用软件Rotor-Gene 5.0及 Excel 7.0对实验结果进行数据分析处理。
标准曲线的绘制 将预试验的PCR产物按照10倍浓度梯度进行稀释,选择1/1000、1/10000、1/100000、1/1000000浓度的稀释产物作为标准品模版,进行real-time PCR反应。通过这四个标准品生成的反应数据,软件Rotor-Gene 6.0根据反应的荧光实时监控数据和标准品的浓度关系,生成标准曲线。通过此标准曲线计算标准曲线所划定的CT值。
数据分析 采用2-△△CT法比较待测指标mRNA在各组间表达水平的差异。
统计学处理
实验数据用均数±标准差表示,各组间数据差异显著性均采用方差分析和t检验,采用SPSS12.0统计软件。
(末完待续)
表1 各组实验大鼠体重、KW/BW、血糖及24h尿蛋白资料(X±S)
| 组别 |
鼠数(n) |
体重(g) |
肾重/体重(mg/g) |
血糖(mmol/L) |
24 h尿蛋白(mg/d) |
| NC |
8 |
310.1±20.6 |
4.01±0.41 |
5.8±1.2 |
5.20±1.16 |
| DMC |
7 |
243.3±45.4* |
5.87±0.68* |
26.7±6.1** |
11.34±1.57* |
| UT-DM |
8 |
250.4±30.6* |
4.31±0.51*△ |
24.9±5.2** |
7.31±1.27*△ |
| FT-DM |
8 |
248.4±30.6* |
4.78±0.52*△# |
25.3±4.7** |
8.14±1.33*△# |
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NC: 正常组,DMC: 糖尿病组,UT -DM: 糖尿病超微粉通心络胶囊治疗组,FT-DM: 糖尿病微粉通心络胶囊治疗组。与NC组相比*P< 0.05,**P<0.01;与DMC组相比△P< 0.05;与UT-DM组相比#P< 0.05。表1相关内容见下期。 |
