 (续3月20日E8版)
气虚型血管内皮损伤模型建立及分组
应用高L-蛋氨酸饲料喂养SD大鼠复制血管内皮损伤模型。选用SD大鼠60只,适应饲养1周,随机分为5组:气虚组、气滞组、气虚通心络组、气滞通心络组和正常组,每组12只。正常组喂普通饲料(AOAC 标准配方);其他组均喂高L-蛋氨酸饲料(在标准配方基础上添加L-蛋氨酸,蛋氨酸浓度为3%),持续6周,以造成高半胱氨酸血症,血管内皮细胞损伤[4]。第5周开始,气虚组和气虚通心络组大鼠力竭游泳2周,以造成气虚模型:在25℃~27℃水温的游泳缸中,每日强迫负重(按大鼠自身体重5%计)游泳至力竭为止。力竭采用两次游泳法,前后相差10 min,以最大限度地耗竭动物的体能。力竭标准为动物明显失调、慌张,鼻部在水面上下浮动,头没入水下10 秒钟不能上浮为力竭标准[5]。气滞组和气滞通心络组大鼠颈部带夹具2周,以造成气滞模型,造模大鼠反应和行为迟缓,皮毛枯黄,眼睛眯小,倦怠食少,爪甲紫暗,尾巴呈棕红色,有鳞片出现[6]。
给药方法
自实验第2周开始,通心络治疗组给予通心络0.4 g/(kg·d)灌喂,其余组自由饮水。各组喂食饲料不变,实验周期为6周。
标本采集
实验至6周后研究者予大鼠禁食,不禁水,于12h后予以股动脉放血处死,并迅速剪开其胸腔分离胸腹主动脉,于主动脉弓处,取一段血管置于4%多聚甲醛溶液中固定,以备HE染色及光镜观察;同时取长约1 cm动脉条,迅速置于4%戊二醛,以备透射电镜观察;将其余的主动脉迅速投入液氮中保存,待测分子生物学指标。
光镜组织学观察
常规HE染色,光镜观察。
透射电镜组织学观察
取材固定同前,常规PBS漂洗,丙酮梯度脱水,Epon812包埋,LKB-V型超薄切片机切片,铅铀双重染色,用日立H-7500透射电镜观察拍片。
总RNA的提取
总RNA的提取采用Trizol一步法。
逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 取总RNA 3 μg,M-MLV反转录酶作用下42℃合成cDNA,分别扩增环氧合酶1(COX-1)、环氧合酶-2(COX-2)、前列腺素环氧合酶(PCS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、内皮转换酶(ECE)及内参β-肌动蛋白(β-actin)基因,各基因及内参β-actin的引物情况见表1。扩增条件为:94℃预变性2 min,94℃ 45s, 退火温度 50s,72℃ 1 min,共33个循环,最后于72℃延伸5 min;反应产物行1.5%的琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像分析仪观察结果,摄取图像并进行产物的灰度扫描。
SAGE谱分析
使用NCBI提供的SAGE文库及在线工具,对这7组基因的表达和实验结果进行定位和初步分析,以辅助分析炎症和氧化应激等相关基因在血管内皮细胞中的表达情况。
统计学处理
数据以Χ±S表示,用SAS 6.12统计软件包进行统计分析处理,数据分析均采用两样本均数比较的t检验,方差不齐者采用t’ 检验。
结果
主动脉壁组织形态学变化
光镜下观察(图1):气虚和气滞组血管内皮细胞广泛损伤脱落,内皮下间隙增宽;正常组动脉内膜光滑完整,单层内皮细胞连接紧密,内膜下间隙小。通心络治疗组内膜光滑完整,单层内皮细胞连接紧密,内皮细胞偶有脱落,但明显好于模型组。
透射电镜下观察(图2):正常组血管壁内皮细胞内含有少量的吞饮小泡、线粒体结构正常,弹力层排列整齐。气虚组和气滞组内皮细胞损伤严重,电镜下可见内皮细胞胞膜不完整,部分或完全脱落,细胞核内染色质边集、浓缩,异染色质增多(箭头所指)。通心络治疗各组之间内皮细胞超微结构的改变无显著差异,明显好于气虚组和气滞组,但与正常组相比,仍可见内皮细胞连接轻度松散,结构基本正常,仅见少量空泡。
(未完待续)
表1 COX-1、COX-2、PCS、eNOS、iNOS、SOD、ECE及β-actin基因引物序列
| 基因 |
引物序列 |
产物大小(bp) |
退火温度(oC) |
| COX-1 |
上游: 5' gggAACCAAAgggAAgAAgC 3' |
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下游: 5' CCAgATCgTggAgAAgAgCA 3' |
427 |
55 |
| COX-2 |
上游: 5' CAgAgTCAgTTAgTgggTAgTTC 3' |
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下游: 5' AATgCCTATTgTgCTTTggAT 3 ' |
496 |
52 |
| PCS |
上游: 5' TACAAAgATgggAAACggCTAA 3' |
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下游: 5' CTggAggAACAACAggAAgTCA 3' |
301 |
53 |
| eNOS |
上游: 5' AgCATCACCTACgATACCCTCAg 3' |
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下游: 5' gCCTCggTTTgTTgCATACTTAA 3' |
435 |
55 |
| iNOS |
上游: 5' TggAgCgAgTTgTggATTg 3' |
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下游: 5' ATCTCgggTgCgATAggTg 3' |
440 |
54 |
| SOD |
上游: 5' ggCTTCTgTCgTCTCCTTgCT 3' |
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下游: 5' gCCACATTgCCCAggTCTCCA 3' |
334 |
58 |
| ECE |
上游: 5' CCgTgCgTgTATgAACgAAAC 3' |
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下游: 5' gCAgCCgTgACTTTgTggTAg 3' |
465 |
56 |
| β-actin |
上游: 5' TCggggCATCggAACCgCTCA 3' |
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下游: 5' gAgACCTTCAagACCCCAgCC 3' |
404 |
55 |
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图1 血管HE染色图像
A:正常组(×400),B:气虚组(×400),C:气滞组(×400),D:气虚+通心络组(×400),E:气滞+通心络组(×400) 。
图2 透射电镜所示内皮细胞超微结构改变
A:正常组(7.0K),B:气虚组(8.0K),C:气滞组(8.0K),D:气虚+通心络组(15.0K),
E:气滞+通心络组(20.0K) 。
图 3 RT-PCR技术所示正常组各基因表达水平(相关内容见下期)
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