R3、R4、RCR和P/O的测定
我们采用Clark氧电极法,取1 mg(蛋白含量)线粒体加入到2.5 ml反应体系中[反应介质为225 mmol/L甘露醇、75 mmol/L蔗糖、10 mmol/L氯化钾(KCl)、20 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、3 mmol/L磷酸盐缓冲液、0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA),以Tris-HCl调至pH 7.4],温度为30℃。孵育1 min后我们加入底物20 μl [氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)链为5 mmol/L谷氨酸+5 mmol/L苹果酸;FAD链为5 mmol/L琥珀酸],再加入45 mmol/L 二磷酸腺苷(ADP)10 μl,测得的氧耗速率为氧化呼吸链呼吸Ⅲ(R3);ADP完全磷酸化后测得的氧耗速率为氧化呼吸链呼吸Ⅳ(R4),呼吸控制率(RCR)=R3/R4,磷氧比(P/O)=ADP量/R3耗氧量。
透射电镜法
我们将固定后的1 mm3脑组织块取出,并按照常规电镜样品制备程序进行漂洗、脱水、浸透及用环氧树脂包埋;将环氧树脂包埋的脑组织标本进行超薄切片后,将切片捞至载网上,干燥后行铅铀双染;在透射电镜下观察网孔中细胞形态及其超微结构的改变并摄片。
统计学处理
我们的所有研究数据以x±s表示,并采用单因素方差分析统计方法,用SNK-q检验进行组间差别的两两比较。
结 果
通心络对大脑中动脉闭塞大鼠神经元超微结构的影响
我们采用透射电镜检测大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠的神经元超微结构(见图,图A~E刊于6月7日A10版)。其结果显示,假手术组(图B)大鼠脑组织神经元细胞结构清晰,胞核中染色质分布均匀,胞浆中粗面内质网、线粒体、核糖体等细胞器结构完整;模型对照组(图A)大鼠脑组织神经元细胞明显水肿,胞核中染色质浓聚,胞浆消失,裸核,部分线粒体皱缩,基质电子密度增加,部分线粒体重度空泡化;通心络1.0 mg/kg(图D)、2.0 mg/kg(图C)组及尼莫地平组(图E)大鼠脑缺血后神经元细胞超微结构的上述改变明显减轻。
通心络对大脑中动脉闭塞大鼠线粒体呼吸功能的影响
为了解缺血对脑细胞线粒体呼吸功能的影响,以及通心络干预对其线粒体呼吸功能的保护作用,我们对MCAO大鼠缺血脑细胞线粒体NAD链和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)链进行了研究。我们通过对R3态、R4态、P/O、RCR等指标变化的分析,观察不同浓度通心络的干预效果,并与尼莫地平的干预效果进行比较。研究结果显示,MCAO大鼠模型对照组缺血脑细胞线粒体NAD链(见表1)和FAD链(见表2)的氧化呼吸链R3态、P/O、RCR明显低于假手术组,氧化呼吸链R4态明显高于假手术组;通心络1.0 mg/kg、2.0 mg/kg 组及尼莫地平组药物干预可明显抑制R3、P/O、RCR的降低;通心络1.0 mg/kg、2.0 mg/kg组R4的升高被抑制,与模型对照组比较差异显著;通心络0.5 mg/kg 组以上指标无显著变化(P>0.05)。
讨 论
通心络对线粒体呼吸链具有保护作用
细胞线粒体通过呼吸链对糖、脂肪和氨基酸等能源物质进行彻底氧化,将所产生的能量大部分贮存在三磷酸腺苷(ATP)中,以满足机体完成各种生理功能的需要。三羧酸循环和氧化磷酸化是细胞氧化的主要过程。前者在线粒体基质内进行,后者在线粒体内膜上进行,这要求线粒体结构完整和功能正常。RCR反映氧化磷酸化的偶联程度及磷酸化对氧化的调控作用。P/O是脱氢与氧化磷酸化反应的总结果,反映呼吸链各组分及磷酸化反应的完整性。本试验结果显示,模型对照组线粒体两条呼吸链的P/O、RCR明显低于假手术组,表明其呼吸功能明显受损,而通心络组这种损伤减轻,提示通心络对线粒体呼吸链具有保护作用。
通心络通过保护呼吸链减轻缺血脑神经元超微结构的改变
脑缺血时,细胞ATP含量迅速减少,大量Ca2+从细胞外向细胞内转移,细胞内Ca2+和线粒体内Ca2+大量聚积。钙超载使磷脂酶被激活,磷脂分解,造成内膜结构损伤,从而使线粒体氧化磷酸化作用减弱或停止,能量代谢障碍,由此产生一系列级联反应,导致细胞损伤。此外,脑缺血时产生的大量自由基、兴奋性氨基酸,酸中毒等也会损伤线粒体,导致线粒体功能障碍[3]。丧失正常功能的线粒体内储存着大量促凋亡分子,在各种凋亡信号的诱导下,它们可通过多条途径引起细胞凋亡[4]。而且,氧和葡萄糖供给减少引起的能量减少还可直接诱导细胞凋亡,其机制尚不十分清楚。本实验中电镜下可见模型组神经元细胞明显水肿,线粒体皱缩,重度空泡化等现象,通心络组MCAO大鼠脑神经元细胞超微结构的上述改变减轻,推测通心络通过改善细胞线粒体呼吸功能进而减轻恶性循环的程度,这可能是其保护作用的机制之一。
通心络通过改善线粒体呼吸功能增强细胞抵抗缺血损伤的能力
本研究还证实,通心络能降低脑组织及线粒体中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量,抑制脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等自由基清除酶的降低(将另文发表)。其进一步说明通心络能改善线粒体呼吸功能,从而增强细胞抵抗缺血损伤的能力。
参考文献
[1] 顿 文,杨立志,周尔风.复方水蛭胶囊药理作用初探.山西医药杂志,1995,24(3):168-169.
[2] Longa EZ, Weinstein PR, Carison S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989, 20(1): 84-91.
[3] Neumar RW. Molecular mechanisms of ischemic neuronal injury.Ann Emerg Med, 2000,36(5):483-506.
[4] Green DR, Reed JC.Mitochondria and apoptosis. Science, 1998,281(5381):1309-1312.
表 1 通心络对脑缺血大鼠线粒体NAD链呼吸功能的影响(n=10, x±s)
组别 R3(nmol·min·-1mg-1) R4(nmol·min-1·mg-1) RCR(%) P/O
假手术组 21.81±1.21 3.91±0.25 5.58±0.31 3.98±0.41
模型对照组 15.42±0.95** 4.92±0.50* 3.13±0.51** 2.04±0.30**
尼莫地平组 18.52±0.80ΔΔ 4.01±0.54 4.62±0.24ΔΔ 3.04±0.34ΔΔ
通心络
0.5 mg/kg 组 16.54±0.92 4.90±0.38 3.38±0.14 2.20±0.17
通心络
1.0 mg/kg 组 18.43±1.10ΔΔ 4.22±0.27Δ 4.37±0.73Δ 3.14±0.44ΔΔ
通心络
2.0 mg/kg 组 20.59±1.01ΔΔ 3.80±0.29ΔΔ 5.42±0.26ΔΔ 3.59±0.42ΔΔ
NAD为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸, R3为氧化呼吸链呼吸Ⅲ态, R4为氧化呼吸链呼吸Ⅳ态,RCR为呼吸控制率,P/O为磷氧比。与假手术组比较**P<0.01, *P<0.05;与模型对照组比较ΔΔP<0.01, ΔP<0.05。
表 2 通心络对脑缺血大鼠线粒体FAD链呼吸功能的影响(n=10, x±s)
组别 R3(nmol·min·-1mg-1) R4(nmol·min-1·mg-1) RCR(%) P/O
假手术组 25.94±1.54 5.02±0.61 5.17±0.43 4.79±0.60
模型对照组 19.42±1.05** 6.14±0.49* 3.16±0.38** 3.69±0.31*
尼莫地平组 22.37±1.25Δ 5.72±0.25 3.91±0.29Δ 4.56±0.47Δ
通心络组
0.5 mg/kg 19.40±0.95 6.04±0.48 3.21±0.32 3.75±0.28
通心络组
1.0 mg/kg 23.15±0.86ΔΔ 5.40±0.27Δ 4.06±0.41Δ 4.47±0.61Δ
通心络组
2.0 mg/kg 24.47±1.01ΔΔ 5.26±0.42Δ 4.65±0.71Δ 4.75±0.26Δ
FAD为黄素腺嘌呤二核苷酸,R3为氧化呼吸链呼吸Ⅲ态, R4为氧化呼吸链呼吸Ⅳ态,RCR为呼吸控制率,P/O为磷氧比。与假手术组比较**P<0.01, 与模型对照组比较*P<0.05, ΔΔP<0.01, ΔP<0.05。
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