 丁素菊教授系上海第二军医大学长海医院神经内科主任、主任医师,博士生导师;现任全军神经病学专业委员会委员、中华医学会上海分会神经病学专业委员会委员、上海市中西医结合学会神经专业委员会委员、上海市神经科学学会理事;担任国家、省市等15种杂志编委;先后参与或主持完成的课题获得国家科技进步三等奖,军队科技进步一、二、三等奖,上海市科技进步二、三等奖共12项;撰写论著100余篇;参与编写专著10余部;共获基金200余万元。
摘要
目的 研究通心络(tongxinluo ,TXL)胶囊对脑缺血大鼠脑细胞超微结构及脑细胞线粒体呼吸功能的影响。
方法 采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型,通过透射电镜观察大鼠缺血后脑组织神经元超微结构的改变;检测线粒体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)链及黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)氧化呼吸链呼吸Ⅲ(R3)态、Ⅳ (R4)态,呼吸控制率(RCR),磷氧比(P/O)等评价呼吸功能指标变化,并与尼莫地平进行比较;观察并评价通心络对脑缺血大鼠脑细胞超微结构及脑细胞线粒体呼吸功能的影响。
结果 电镜照片显示,TXL组大鼠脑组织神经元在缺血后的结构破坏情况得到改善,线粒体呼吸功能明显改善。
结论 通心络对大鼠缺血脑细胞有明显保护作用,其作用机制与通心络能改善缺血脑细胞线粒体呼吸功能有关。
通心络胶囊是以络病理论为指导,运用蜈蚣、全蝎、水蛭、土鳖虫、蝉蜕、人参、赤芍、冰片等组成的复方中药制剂,具有益气、活血化瘀、搜风解痉、通络等功能。其中水蛭含有多种生物活性物质,主要成分是水蛭素。研究表明,水蛭素是目前作用最强的凝血酶抑制剂[1],它可能在抗缺血损伤中有重要价值。目前,对于通心络已有众多的临床及基础研究结果报告,但有关其对线粒体的影响从未见报告。本研究在线栓导致大鼠脑缺血损伤的基础上,研究通心络对脑组织细胞线粒体呼吸功能的影响。
 材料和方法
仪器和试剂
通心络胶囊干粉(0.7 克干粉/克生药,石家庄以岭药业股份有限公司),尼莫地平注射液(尼立苏,山东新华制药股份有限公司),Himac CR21低温超速离心机(日立公司),SP-2溶氧测定仪(中科院上海植物生理研究所),721型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂),XWTD-204型台式自动平衡记录仪(上海大华仪表厂),8711Ⅰ Multitemp自动温控仪(中国胶江新华仪器厂),H-7000型透射电镜(日立公司)。其余试剂均为分析纯。
实验动物
普通级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠60只,每只体重250 g左右,由第二军医大学训练部实验动物中心提供,动物合格证号:SYXK(军)2002-042,饲养于第二军医大学长海医院实验动物中心。我们在大鼠自由进食、进水、适应环境1周后开始进行实验。
动物分组及模型建立
我们将大鼠随机分为模型对照组、假手术组、尼莫地平组(1 mg/kg)和通心络不同剂量给药组(0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg),每组10只。我们参考Zea Longa方法[2],应用自制改良尼龙栓子复制大鼠右侧大脑中动脉缺血模型,假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉分离。术后,我们给予大鼠连续灌胃5天(假手术组、模型组给予等容积生理盐水)。
线粒体标本的制备
我们给予试验大鼠10%水合氯醛过量麻醉并处死、断头后,在其固定部位剪下体积为1 mm3的右侧脑半球前脑组织,并迅速放入预冷至4℃的2.5%戊二醛溶液中固定24小时,以待透射电镜检测。
我们用其余右前脑组织制备线粒体标本。其方法是用预冷至4℃的生理盐水冲洗脑组织,并用滤纸吸干后称重;按8 ml/L脑组织加入4℃的分离介质[成分为225 mmol/L甘露醇,75 mmol/L蔗糖,1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),0.25 %胎牛血清并以三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液调pH至7.4]于Teflon芯匀浆器中,匀浆至无脑组织块;匀浆后予以3000 r/min离心3 min,取上清液10000 r/min离心10 min,弃除上清液,沉淀部分加入8滴分离介质,以Lowry法测定蛋白浓度。所有过程均在0℃~4℃条件下进行。
A 模型对照组(×5000)
模型对照组大鼠脑组织神经元细胞明显水肿,胞核中染色质浓聚,胞浆消失,裸核,部分线粒体皱缩,基质电子密度增加,部分线粒体重度空泡化。
B 假手术组(×9000)
假手术组大鼠脑组织神经元细胞结构清晰,胞核中染色质分布均匀,胞浆中粗面内质网、线粒体、核糖体等细胞器结构完整。
C 通心络2.0 mg/kg 组(×12000)
D 通心络1.0 mg/kg 组(×10000)
E 尼莫地平组(×12000)
与模型对照组相比,通心络2.0 mg/kg、1.0 mg/kg和尼莫地平组大鼠脑缺血后神经元细胞超微结构的改变明显减轻。
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